Сравнение методов определения общей бактериальной обсемененности молока


Одним из основных показателей качества молока сырья и выпускаемой продукции является показатель бактериальной обсемененности, характеризующий уровень гигиены производства, транспортировки и хранения продукции.

На сегодняшний день помимо классического арбитражного метода (стандартный метод подсчета бактерий на чашках Петри) ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа» существуют различные методы оценки бактериальной обсемененности, которые отличаются условиями и временем проведения измерений.

В настоящее время на перерабатывающих предприятиях применяются методы, основанные на оценке метаболической активности, так и классические методы определения, к которым можно отнести следующие:

  • метод определения редуктазы с метиленовым голубым метод основан на восстановлении метиленового голубого окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоке микроорганизмами. По продолжительности обесцвечивания метиленового голубого оценивают бактериальную обсемененность сырого молока. Результаты данного метода можно использовать как косвенный качественный показатель бактериальной обсемененности молока-сырья. Аналогичный метод определения общей бактериальной обсемененности молока – метод определения редуктазы с резазурином, который тоже является качественным методом. Оценка результатов осуществляется по продолжительности изменения окраски резазурина.
  • метод определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов основан на способности мезофильных аэробных и факультативно – анаэробных микроорганизмов размножаться на плотном питательном агаре при (30±1)ºС .
  • метод определения общей бактериальной обсемененности по концентрации кислоты (лактат, пируват), аммиака и ионов аммония, по измерению бактериальной теплопродукции ГОСТ 27930-88 «Молоко и молочные продукты. Биокалориметрический метод определения общего количества бактерий». Метод основан на калориметрическом измерении тепловой мощности, выделяемой в процессе жизнедеятельности микрофлоры молока, которая является энергетической характеристикой ее физиологической активности.
  • метод компании «Люмтек» ГОСТ Р 52415-2005 «Молоко натуральное коровье - сырье. Люминесцентный метод определения КМАФАнМ», основанный на определении бактериальной АТФ посредством люциферинлюциферазной реакции с люминометрической регистрацией возникающей люминесценции. Данный метод распространяется на сырое коровье молоко. Данная методика позволят измерять с наименьшим пределом обнаружения КМАФАнМ не менее 50 тыс. КОЕ/см3.
  • метод измерения сопротивления (импеданса). Метод основан на измерении электрохимических свойств культуральной среды. Изменение импеданса происходит в питательной среде по мере того, как ее химический состав изменяется в результате роста и метаболической активности микроорганизмов. При этом незаряженные или слабозаряженные составляющие питательной среды превращаются в сильнозаряженные конечные продукты: белки метаболизируются до аминокислот, углеводы и жиры до органических кислот. Эти электрохимические изменения приводят к существенным изменениям импеданса, экспоненциальные изменения сигнала могут наблюдаться, когда количество микробных клеток достигает порога 106 – 107 клеток/мл. Среди разработанных и применяющихся в настоящее время исследовательских микробиологических систем, предназначенных для ускоренного обнаружения микроорганизмов на основе импедансных технологий, наибольшее распространение получил микробиологический анализатор "Бак Трак 4300" и «БиоТрак 4250» производства австрийской фирмы "SY-LAB".

Целью данного исследования было сравнение арбитражного классического и импедансного методов на примере определения общей бактериальной обсемененности молока сухого обезжиренного (рис.1). Измерения проводили на 14 образцах сухого обезжиренного молока одного производителя и 3 дат выработки.

Бактериологическое определение числа колониеобразующих единиц проводили согласно ГОСТ 9225-84 на питательной среде для определения КМАФАнМ производства «Биокомпас-С» (г.Углич). Определение КМАФАнМ импедансным методом проводили на приборе «БиоТрак 4250», согласно методическим указаниям МУК 4.2.1111-02, а также стандартам DIN10115 и DIN10120 (основные принципы обнаружения и количественного определения микроорганизмов импедансным методом).


Таблица 1.

№ измерения КМАФАнМ, КОЕ/г
по результатам классического метода
КМАФАнМ, КОЕ/г
по результатам импедансного метода
1 2 3
1 1,0 х104 1,43 х104
2 5,0 х104 2,91 х104
3 4,0 х103 4,21 х103
4 3,50 х102 6,18 х102
5 3,1 х103 5,68 х103
6 2,0 х102 2,31 х102
7 1,0 х101 2,10 х101
8 1,0 х106 3,77 х105
9 1,0 х105 2,08 х105
10 5,0 х104 5,50 х104
11 3,0 х103 3,58 х103
12 4,0 х102 4,69 х102
13 1,0 х102 1,20 х102
14 2,0 х103 1,10 х104


Результаты определения общего микробного числа в сухом обезжиренном молоке классическим и импедансным методами.

По полученным результатам составили уравнение регрессии, его графическое изображение и определили коэффициент детерминации R2 (рис.1.).

Пропорциональность количества микроорганизмов в образце по отношению к времени определения изменения импеданса выражается математически с помощью линейной регрессии. Метрологические характеристики метода измерения определяются коэффициентом корреляции (r) и дисперсией (syx), выражаемой в логарифмических единицах. Чем ближе коэффициент корреляции к идеальному значению -1, тем более высокая корреляция между импедансным и классическим методом.

Время определения, ч

Рис.1 График регрессии импедансного метода определения КМАФАнМ в молоке сухом обезжиренном (где r=-0,9785; syx=0,3)


Результат полученной регрессии можно оценить как измерение (при пределе доверительной вероятности Р=0,95) 97% значений описываемых уравнением в зоне шириной ±0,3 логарифмических единицы.

Импедансный метод продемонстрировал достаточно высокое сходство с классическим методом по коэффициенту детерминации и метрологическим показателям.

К положительным характеристикам прибора БиоТрак 4250 относится возможность одновременного определения нескольких санитарно-значимых показателей (БГКП, дрожжи и плесени, сальмонеллы), за счет использования селективных питательных сред.

В дальнейшем планируется данный метод апробировать на большем количестве объектов исследований (молоко сырье, молоко пастеризованное, кисломолочные продукты и т.д.), провести измерения в соответствии с требованиями ИСО 16140-2003 «Микробиология пищевых продуктов и кормов животных. Протокол валидации альтернативных методов.» и стандартом ММФ 161 А «Молоко. Количественное определение бактериологического качества. Руководство по установлению и верификации уравнения пересчета результатов альтернативного и арбитражного методов» и метрологически аттестовать.

23.01.2017